RNA病毒包括SARS、MERS、流感、埃博拉、寨卡和2019新冠等多种重要人类致病病原，其基因组复制过程完全不涉及DNA形式，因此需要自身编码的依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，简称RdRP）来主导完成。作为RNA病毒必须且最为保守的蛋白，RdRP催化RNA合成的分子机制是了解RNA病毒本质和研制抗RNA病毒的核苷类药物（如丙肝特效药索非布韦、抗新冠药物瑞德西韦、法匹拉韦等）的关键基础。
国家蛋白质科学研究（上海）设施用户中国科学院武汉病毒研究所龚鹏研究员长期从事病毒RdRP的催化与调控机制研究，近期发现RdRP在完成催化反应后RNA产物链先于模板链向上游移动，而RdRP独特的催化基序G（motif G）与模板链的“锁定”相互作用很可能是造成RNA双螺旋不对称运动的主要因素。研究成果于2020年5月25日以“Stringent control of the RNA-dependent RNA polymerase translocation revealed by multiple intermediate structures”（多种中间体结构揭示RdRP对转位过程的严格控制）为题在Nature Communications上在线发表。
为充分揭示RdRP转位机制和完整绘制RdRP核苷酸添加循环图，该研究团队充分结合晶体学与酶学方法开展研究，通过改变肠道病毒RdRP-RNA复合物晶体浸泡实验中的底物NTP和副产物焦磷酸的浓度，同时结合晶体浸泡时间扫描策略，获得了正向转位和逆向转位的中间体结构。在这两类中间体结构中，RNA产物链均先于模板链发生移动，进一步提示了基序G的“锁定”作用对转位过程的控制（图1，PDB号：6LSE、6LSF）。与正向转位中RNA双链始终维持原有的碱基对相互作用不同，逆向转位中间体提示RNA双链间发生“滑动”，导致原有碱基对相互作用被打破，重新建立了亚稳定的不完全配对的双链。这一结果一定程度上提示了聚合酶催化的逆向反应比正向反应更难发生，同时也为理解聚合酶的纠错功能提供了重要依据。
为了观测到转位末期基序G“锁定”作用如何打破，从而允许模板链发生移动，研究团队系统性分析了基序G参与锁定的两个关键氨基酸位点（对应肠道病毒RdRP的114和115位），发现大多数RdRP在这两个位点均使用四种小侧链氨基酸（G：甘氨酸；A：丙氨酸；S：丝氨酸；T：苏氨酸），推测上述“锁定”作用很可能由空间位阻实现控制。在测试了这两个位点的G/A/S/T四种氨基酸的全部16种组合后，发现多数突变体RdRP仍然可以维持催化功能，但催化效率（由kcat/KM,NTP评测）比之野生型发生不同程度的变化，提示突变可能对“锁定”作用产生调节（图2）。研究团队通过进一步尝试突变体RdRP-RNA复合物结构解析，利用一种kcat和野生型相当但KM,NTP五十倍于野生型（即NTP亲和力远低于野生型）的突变体成功获得了模板链“解锁”的转位后期中间体结构（图3，PDB号：6LSG、6LSH）。
至此，龚鹏研究组系统性阐释了RdRP核苷酸添加循环中化学反应前的催化中心关闭（Shu and Gong, PNAS 2016）和化学反应后的转位这两个重要构象变化的精细过程，相对完整地绘制了循环图。为进一步研究RdRP错配、基因组复制纠错和研制针对RNA病毒的核苷类高效和特效药物奠定了重要基础。研究团队进一步提出，RdRP通过“锁定”相互作用对转位实行严格控制很可能是为了保障模板碱基的精确定位和高效催化，类似的模板锁定以及转位与催化的偶联机制很可能在其他类型的聚合酶中同样存在。
本项目得到了国家蛋白质科学研究(上海)设施BL19U1线站的技术支持。
（论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-16234-4）。
图1. 新解析的RdRP正向与逆向转位中间体结构。在每种转位中间体结构的产物链（product）均由两种混合态（正向：S6A/S6B；逆向：S6RA/S6RB）构成，展示了产物链先于模板链运动的特征，其中正向转位（A）RNA双链碱基对得以维持（黑色虚线），而逆向转位双链间发生滑动（红色虚线显示新形成的碱基对，其中实心和空心圆标识分别表示常规和摇摆碱基对）。
图2. 针对RdRP独特基序中参与模板链“锁定”的两个氨基酸位点的系统性酶学表征。A）RdRP在相关位点（红框标识）多为G/A/S/T等小侧链氨基酸。B）基于快速反应装置和荧光实时检测的RdRP单步反应表征方法。C）部分“锁定”位点突变体具有与野生型（WT）相近的催化效率（kcat/KM）。基于酶反应动力学特征将WT及突变体划分为五种不同类型（I-V）。D）T114S-S115T（ST）突变体KM值约为WT的50倍。
图3. RdRP分步不对称转位过程分解示意图。左：转位前，基序G锁定RNA模板链，对模板链来说，基序G则相当于跨栏运动员需要跨越的栏架；中一：在转位前期，产物链先于模板链发生移动，模板链仍处于锁定状态；中二：转位后期，锁定相互作用被打破，模板链发生移动，跨越基序G；右：转位后，模板+1位核苷酸（橘黄色）到达-1位，基序G重新锁定模板。
