蛋白质设施用户合作揭示CRISPR-Cas系统适应阶段新机制
时间 : 2021-02-26     

2021年2月22日,国家蛋白质科学研究(上海)设施用户四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室陈强和余雅梅团队,与美国俄亥俄州立大学傅天民团队合作,在国际知名期刊《Nucleic Acids Research》在线发表了标题为“Mechanisms of spacer acquisition by sequential assembly of the adaptation module in Synechocystis”的研究成果。该团队研究人员通过生物化学实验探明了Cas1、Cas2、Cas4三个蛋白的相互作用关系,并且解析了Cas1-Cas2-Spacer三元复合物的晶体结构和Cas1-Cas4二元复合物的电镜负染结构(图1),阐明了Cas4参与外源DNA捕获与整合的新机制。 

 
    
图1. Cas1-Cas2-Spacer三元复合物和Cas1-Cas4二元复合物结构    

CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌经过上百万年的进化,产生的一种非常高级和复杂的抵抗噬菌体和外来基因入侵的获得性免疫系统。这种获得性的免疫系统可以储存先前的免疫记忆,当同样的噬菌体或者外来基因再次入侵时,宿主能够准确识别入侵者,并对其遗传物质进行切割和修改,抑制入侵者在宿主中的复制和生长,从而起到保护宿主的作用。CRISPR-Cas系统主要分为三个阶段:1)适应(也称为间隔序列的整合)阶段,一段短的外源入侵基因(间隔序列)被Cas1、Cas2等相关蛋白插入到CRISPR位点形成免疫记忆;2)Cr-RNA的成熟阶段,CRISPR位点转录并被相应Cas蛋白加工形成成熟的Cr-RNA;3)干扰阶段,Cr-RNA装载到相应的Cas蛋白或Cas蛋白复合物中并引导Cas蛋白对再次入侵的外源基因进行切割,保护宿主的正常生长。近年来,Cr-RNA的成熟和干扰两个阶段的分子机制得到了广泛和深入的研究,相对而言,适应阶段的许多分子机制仍然不为人所知。  

该团队研究发现,在I-D 型系统中,Cas1、Cas2、Cas4 三个蛋白并不是以 Cas1-Cas2-Cas4 复合物的形式出现。Cas4和Cas2竞争性地与Cas1结合,且Cas4与Cas1的亲和力强于Cas2与Cas1,通过形成 Cas1-Cas4和 Cas1-Cas2-DNA 两种复合物,这两种复合物按次序先后参与间隔序列的整合。因此,不同于已报道的I-C型系统, I-D型系统的间隔序列整合分为两个步骤进行:1)间隔序列的加工;2)间隔序列的整合(图2)。在此过程中,Cas1-Cas4复合物通过Cas4的PAM序列特异性的内切酶活性对间隔序列进行识别和加工,加工成熟的间隔序列又与Cas1、Cas2形成比Cas1-Cas4复合物更加稳定的Cas1-Cas2-Spacer复合物,将间隔序列插入到CRISPR位点,完成间隔序列的整合。

  
    
图2,Type I-D型CRISPR-Cas系统适应阶段分子机制  

CRISPR-Cas基因编辑技术已经广泛应用于全球实验室,对CRISPR-Cas系统更加深入的了解不仅拓宽了人类的知识边界,还有助于开发更新一代的基因编辑工具。  

国家蛋白质科学研究(上海)设施BL19U1线站工作人员为论文的X-射线晶体衍射数据的收集提供了及时高效的支持。  

(蛋白质上海设施提供)