蛋白质设施支持用户张余研究组解析了叶绿体基因转录机器构造
时间 : 2024-03-07     

  

2024年3月1日,上海高等研究院国家蛋白质科学研究(上海)设施支持中国科学院分子植物科学卓越创新中心用户张余团队和华中农业大学周菲团队合作解析了叶绿体基因转录机器构造。研究团队基于叶绿体转化技术,成功建立了烟草叶片中纯化内源PEP的方法,解析了叶绿体RNA聚合酶PEP复合物和PEP转录延伸复合物的高分辨率冷冻电镜结构,揭示了叶绿体基因转录机器的亚基组成、亚基组装方式、特殊功能和功能适应性演化,并为进一步研究叶绿体中转录调控的机制和功能提供了结构基础。相关研究在Cell上以“Cryo-EM structures of the plant plastid-encoded RNA polymerase”为题发表了封面研究论文。 

蛋白质设施电镜分析系统利用冷冻透射电镜和计算存储集群,支持研究团队进行冷冻样品质量筛选、海量冷冻电镜数据收集和数据前处理,进而解析得到分辨率为3埃的烟草叶绿体RNA聚合酶PEP-PAP超大复合物冷冻三维结构。技术系统孔亮亮、李光一和段佳琳提供了重要的技术支撑。 

叶绿体中的光合作用将光能转化为化学能,吸收二氧化碳,释放氧气,是地球生物圈的重要塑造者。叶绿体大约在15亿年前通过蓝藻内共生进化而来(图1)。在进化过程中,叶绿体基因要么被废弃,要么逐渐转移到细胞核染色体中,导致大多数陆地植物叶绿体基因组中只保留了110-130个基因,其中大部分基因编码与基因转录、蛋白翻译和光合作用活动相关的组分。叶绿体基因组中保存着两种类型的RNA聚合酶,分别是细菌型质体编码的RNA聚合酶(PEP)和噬菌体型核编码的RNA聚合酶(NEP)。 

叶绿体PEP在原始质体发育过程中起重要作用,并作为主要的RNA聚合酶在成熟的叶绿体中转录80%的叶绿体基因。PEP核心(PEP core)保留了细菌RNA聚合酶类型的结构,包括2个α亚基、1个β亚基、1个β'1亚基和1个β'2亚基,但不含ω亚基,整体分子量约为450 kDa。PEP的独特特点是若干细胞核编码真核起源的PEP相关蛋白(PEP associate proteins,PAPs)与PEP core紧密相互作用,并组装成一个分子量约为1 MDa的超复合物。每个PAP突变表型与PEP core亚基突变体类似,表现出白化/苍白等叶绿体发育缺陷表型。尽管大量工作探索了叶绿体PEP的组成和功能,但是真核起源的PAPs如何与和细菌起源的PEP core进行复合物组装以及如何调控PEP 的转录活性等,这些问题尚未得到解答。

 
图1:叶绿体的进化 

为了纯化内源性烟草PEP超大复合物,研究团队构建了转基因叶烟草,在叶绿体基因组rpoC2基因的3'端插入了一个编码串联His-Flag标签的DNA片段。随后利用30-45的天转基因烟草叶子,进行亲和、离子交换和分子排阻层析等步骤纯化,最终得到了高纯度的PEP超大复合物(图2),并具有转录催化活性。

 
图2:烟草PEP的纯化策略 

PEP结构显示PAP12的结合位置与蓝藻RNA聚合酶的ω亚基相同,且一级序列和三维结构高度保守,表明PEP包含一个完整的细菌来源RNA聚合酶,构成了PEP的“催化模块”。另外15个真核起源的PAPs结合在PEP core外围,组成了不同的功能模块,包括“支架模块”、“保护模块”、“RNA模块”和“调控模块”,是目前已知最复杂的基因转录机器(图3)。“支架模块”由七个亚基(PAP1、PAP3、PAP5、PAP7、PAP8、PAP11和PAP14)组成。与PEP的相互作用界面较大,约占的PEP core表面一半以上,并与PEP core形成了多个亚基间结构域, 不仅稳定了“催化模块”还为其他模块提供结合支架。“保护模块”由Fe-SOD异源二聚体组成,包含PAP4和PAP9两个亚基(也被称为FSD3和FSD2),通过其超氧化物歧化酶功能,保护PEP免受叶绿体中超氧化物攻击。“RNA模块”由单个亚基PAP2组成,结合在RNA合成通道外围,以序列特异性的方式结合RNA,参与并协助 RNA转录后加工。“调控模块”由四个亚基PAP6、PAP13和两个PAP10(也被称为FLN1、FLN2和Trx z)组成,参与保护“催化模块”α亚基的C端结构域,可能参与调控PEP的转录活性。这些功能模块均由细胞核基因组编码,其在细胞质中被翻译后转运到叶绿体与PEP 的催化模块形成复合物,实现细胞核对叶绿体基因表达的控制。

 
图3:叶绿体PEP模块组成及其功能 

研究团队最后对PEP-PAP蛋白亚基进化分析,发现叶绿体基因转录机器PEP-PAP的演化时间与植物登陆时间基本一致(图4),陆生植物叶绿体基因转录机器通过招募这些额外的亚基,演化出独特的功能和调控机制,帮助其适应陆地环境和特殊的生命周期。

 
图4:叶绿体PEP的进化 

在基础研究层面,本研究为进一步探索叶绿体基因转录机器的工作模式、理解叶绿体的基因表达调控方式、以及改造叶绿体基因表达调控网络打下了基础。在合成生物学应用层面,本研究为植物叶绿体生物反应器的效率提升提供了着手点,助力重组疫苗、重组蛋白药物、和天然产物的生产。在“碳达峰”和“碳中和”的双碳目标下,本研究为光合作用系统基因表达水平的提高提供了新思路,助力植物高效碳汇。 

 原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424000631 
   (蛋白质上海设施提供)