2025年3月17日，上海科技大学王皞鹏、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心许琛琦、美国匹兹堡大学医学院Dario Vignali、北京大学肿瘤医院孔燕及百济神州沈志荣团队合作，在《Cell》杂志上发表了题为“Ligand-induced ubiquitination unleashes LAG3 immune checkpoint function by hindering membrane sequestration of signaling motifs”的研究文章。该研究首次阐明了免疫检查点LAG3受体激活的分子开关机制，并开发了基于功能性生物标志物的疗效预测体系，为靶向免疫检查点的精准治疗提供了新策略。
免疫检查点是T细胞表面的抑制性受体，肿瘤可通过激活这些受体来抑制T细胞功能，从而实现免疫逃逸。免疫检查点抑制剂可解除这种抑制作用，激活机体的抗肿瘤免疫响应，相关研究曾获2018年诺贝尔生理学或医学奖。继PD-1和CTLA-4之后，LAG3靶向药物于2023年获得美国FDA批准上市，成为第三个获批的免疫检查点药物，标志着肿瘤免疫治疗的又一次重要进展。与其他免疫检查点疗法类似，LAG3免疫疗法的临床响应率仍然不高，仅有部分患者从中获益。如何精准筛选可能获益的患者群体成为当前急需突破的临床瓶颈。破解这一难题需要对LAG3的作用机制有深入的认识。然而，自1990年LAG3被发现以来，其配体结合如何触发LAG3受体活化的分子机制一直不清楚，成为困扰该领域多年的关键科学问题。
为探究LAG3受体的激活机制，研究团队利用国家蛋白质科学研究（上海）设施质谱系统对LAG3蛋白的翻译后修饰（PTM）进行了系统分析，通过bottom-up的手段对样品进行了胶内酶解和质谱数据的采集分析等工作，发现LAG3受体结合配体后，其K498位点发生快速多泛素化修饰。这种泛素化修饰不会介导LAG3的降解，反而对LAG3的功能具有关键调控作用。
图1. 配体结合触发LAG3 K498位点泛素化修饰
LAG3近膜区富含碱性残基信号基序（Basic residue Rich Sequence，又称BRS基序），紧随其后的是关键信号域FSALE以及泛素化位点（图2A）。为了探究LAG3免疫抑制功能的分子机制，研究人员依托蛋白质设施核磁系统Bruker 900 MHz和Bruker 600 MHz仪器，检测了LAG3胞内区与膜脂的相互作用。为进行互作检测，研究人员合成了包含FSALE和BRS的LAG3 N端胞内区（LAG3-NCR, R475-K498）以及胞内区全长（LAG3-FL）的两种多肽；质膜双层类膜体系选用了bicelle体系，组分分别为模拟生理脂质组成的PMLC（plasma membrane-like composition；30% POPS, 10% POPG, 60% POPC）以及中性的POPC单一组分。源于LAG3-NCR中W478的芳香环荧光发射光谱（AFE）显示，包含BRS基序的LAG3-NCR和LAG3-FL两种多肽均与酸性PMLC bicelle互作而与POPC bicelle无互作（图2A-B）。作为核磁样品，研究人员合成了仅对关键信号域FSALE中的F483和L486进行13C和15N选择性标记的多肽，测定了多肽在bicelle体系的15N-HSQC发现。与溶液中的15N-HSQC相比，LAG3-NCR和LAG3-FL两种多肽的F483和L486在PMLC bicelle中均显示信号峰化学位移变化和/或峰强减弱，而在POPC bicelle中则几乎无变化，因而同样确认了LAG3胞内区与酸性脂质的特异性互作（图2C-D）。为了检测关键信号域FSALE在脂质双层的位置，研究人员测定了带有过滤掉分子内NOE信号功能的13C-filtered NOESY谱图（图2F），旨在检测多肽与脂质分子之间的分子间NOE信号。图2E展示了F483的芳香环侧链信号，图2F展示了芳香环侧链与脂质分子酰基氢之间的NOE信号（化学位移1.3 ppm的位置），这些结果表明FSALE包埋在bicelle脂双层的疏水区。随后，研究人员制备了LAG3-NCR与ubiquitin（UB）的融合蛋白，测定了该融合蛋白与LAG3-NCR多肽在PMLC bicelle中的荧光偏振。结果显示，融合蛋白的荧光偏振值与LAG3-NCR多肽相比明显减弱，表明LAG3的泛素化妨碍了LAG3的膜结合，将LAG3从膜上释放了出来，使其处于开放构象，从而对其功能进行调控。综合上述结果，研究人员提出了由泛素化介导的"埋藏-释放"动态调控机制，由此揭示了一种全新的受体活化方式。
图2. 核磁实验揭示LAG3胞内信号区包埋在膜脂双层内
研究人员依托动物设施，在MC38和B16等小鼠肿瘤模型中，研究证实泛素化缺陷型LAG3显著削弱肿瘤免疫逃逸能力，凸显该修饰在LAG3介导的抗肿瘤免疫应答中的核心作用。基于上述机制，团队创新开发了功能性生物标志物，其检测值在治疗获益组较非获益组提升达51.7倍（p=0.0379），显著优于传统表达水平标志物（仅6.5倍差异且无统计学显著性，图3）。这一突破为LAG3靶向治疗的精准患者分层提供了全新工具。
图3. 表征LAG3功能的生物标志物可预测LAG3药物疗效
综上，该研究不仅揭示了泛素化介导的LAG3动态调控新机制，还开发了新型的疗效预测生物标志物，为基于LAG3的免疫检查点阻断疗法提供了新的思路和临床应用前景。
原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00199-0
